十八禁啪啪啪一区二区三区,国产偷抇久久精品a片蜜臀a,久久久久亚洲伊人久久久,操逼视频sss

歡迎訪問西安昊興生物科技有限公司網(wǎng)站

返回首頁|聯(lián)系我們

全國統(tǒng)一服務(wù)熱線:

4000298128
技術(shù)文章您當(dāng)前的位置:首頁 > 技術(shù)文章 > 逆轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR

日期:2021-07-26瀏覽:3615次

RT-PCR,逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱反轉(zhuǎn)錄PCRReverse Transcription PCR),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中,RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNAcomplementary DNA,cDNA),再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

基本原理:

用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成與其互補的DNAcDNA)的過程。因為mRNA末端存在Poly A,所以用Oligo dT作為通用引物與其互補。商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒里通常除了Oligo dT之外,還可以用隨機引物,但一般用Oligo dT引物就可以了。

 

重要參數(shù):

不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同;因此,適合于一種mRNA拷貝的條件可能對另一種mRNA不適合。一般來說,從事不均一mRMA群體時,所使用的條件是導(dǎo)致cDNA合成的終產(chǎn)量達(dá)到最大,下述參數(shù)十分重要。

1、逆轉(zhuǎn)錄酶: 有兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化以mRNA為模板,oligo(dT)作為引物,合成與mRNA互補的cDNA鏈。一種來自純化的 AMV,由兩條肽鏈組成,具有聚合酶活性和很強的RNAH活性,它最適溫度是42℃,最適pH8.3。在高反應(yīng)溫度時可消除mRNA的二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙,然而高水平的RNAH的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長度。另外,禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內(nèi)切酶污染。

另一種是Mo-MLV,是單肽鏈的,有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNAH活性,最適溫度37℃,最適pH7.6,較弱的RNAH活性對獲得2-3kbmRNA的全長cDNA有很大好處。在第一鏈反應(yīng)前可用氫氧化甲基汞處理,破壞mRNA的二級結(jié)構(gòu),這一步對于最適反應(yīng)溫度較低(37)℃的鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)可能更為重要。臨合成cDNA第一鏈之前加入過量的巰基試劑,可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。

2、單價陽離子: 離子條件基本上影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。對于cDNA長度的最適鉀離子濃度為140-150mM。

3、二價陽離子: 對于反轉(zhuǎn)錄酶活性來說,二價陽離子是必需的。低于4mM Mg2 未能觀察到活性;產(chǎn)生全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的最適濃度是6-10mM。

4、脫氧核苷三磷酸: 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對于有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下,全長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。

 

注意事項:

1、RNA 提取一定要迅速,樣本要新鮮,組織盡量在液氮中研磨;

2、RNA 提取完馬上進行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延,新提的RNA很容易降解;

3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程,需建立無RNAase環(huán)境,以避免模板RNA降解。

 


上一篇:分子生物學(xué)常用數(shù)據(jù)庫匯總及推薦

下一篇:防爆冰箱了解多少?

QQ咨詢 聯(lián)系方式 二維碼

服務(wù)熱線

17791407282

掃一掃,關(guān)注我們

中文 内射 亚洲 人妻| 国产日韩乱码精品一区二区| 国产综合精品久久亚洲蜜桃| 骚淫荡密穴视频| 野花社区www在线观看| 国产最新理论片在线观看| 多毛熟女HD∨idOS| 日本黄大片动漫视频网站| 国产区精品福利在线社区| 91popny九色在线| 警察被两个混混脱裤玩j视频| 干死我吧,操我逼逼视频| 男生鸡鸡捅进女生坤坤里| 野外玩弄大乳孕妇| 嗯啊用力快点肉棒插视频| 欧美日韩欧美互動與交流| 538免费视频同性人妖| 国产福利视频区一区二区| wwwmeinvcao| 国产偷窥女洗浴在线观看| 叶山小百合中文字幕在线| 干日本美女小穴| 国产操嗨艹技师| 97影院理论午夜伦不卡偷| 第九色五月婷婷| 老婆出轨时接听老公电话 | 一本大道之中文日本香蕉| AV无码天堂网在线观看| 国产aaa免费视频国产| 亚洲精品视频一二三四区| 亚洲熟女少妇一区二区三区| 美女艹逼啊啊啊啊,啊啊| 久久福利新地址| 无码嫩小泬无套在线观看| 观看草嫩逼网站| 被医生按摩玩到高潮视频| 天天综合网永久入口导航| 欧美日韩国产精品| 女生被男插视频网站免费| 女技师偷拍推油对白视频| 大鸡巴插入小穴白丝jk|